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逆水寒捏脸:11684809910 AP法凋亡試劑盒

11684809910 AP法凋亡試劑盒
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產品特點:
產品名稱: 11684809910 roche原裝
現貨促銷 原價6152 促銷六折
英文名稱:In Situ Cell Death AP
產品貨號: 11684809910
產品產地: Roche

特價:6152元 :
  11684809910 AP法凋亡試劑盒的詳細資料:

 

 

          11684809910 AP法凋亡試劑盒

 

產品簡介:

 

                 

產品編號   品名/ Packsize的
11684817910  

在原位細胞凋亡檢測試劑盒,過氧化物酶 
1包(高達50測試)

 

優點

敏感:細胞凋亡(細胞染色)標簽的大強度高于缺口翻譯方法

快速:使用熒光的dUTP允許后直接TUNEL反應,但在此之前的二次檢測系統除了對樣品的分析

方便:直接標記程序,使用熒光素-dUTP標記允許在檢測過程中的TUNEL反應效率的核查

準確:在分子水平(DNA鏈斷裂)和細胞凋亡的早期階段的細胞識別凋亡鑒定

靈活:無基板;提供了選擇的機會,選擇染色過程

 

11684809910 AP法凋亡試劑盒    

 

  6152 六折特價【

Situ Cell Death AP  細胞凋亡檢測試劑盒AP法    

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產品明細:

 一、 原理:

TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素(fluorescein)標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端,并與連接辣根過氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的熒光素抗體特異性結合,后者又與HRP底物二氨基聯苯胺(DAB)反應產生很強的顏色反應(呈深棕色),特異準確地定位正在凋亡的細胞,因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞;由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂,因而沒有3‘-OH形成,很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細胞樣本(細胞涂片)在單細胞水平上的凋亡原位檢測?;箍捎τ糜誑怪琢鲆┑囊┬蘭?,以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

二、 器材與試劑

器材:光學顯微鏡及其成像系統、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的加樣器及槍頭等;

試劑:試劑盒含TdT 10×、熒光素標記的dUTP 1×、標記熒光素抗體的HRP;自備試劑:PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(臨用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8)或細胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,臨用前配制)、蘇木素或甲基綠、DNase 1(3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5, 10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。

三、 實驗步驟

操作流程圖:制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照。

具體操作步驟(石蠟包埋切片的檢測):

1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min;

2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;

注:上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理

4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C(溫度、時間、濃度均需摸索)或者加細胞通透液8min;

5. PBS漂洗2次;

6. 制備TUNEL反應混合液,處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標記的dUTP液混勻;而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液,陽性對照組先加入100μl DNase 1,反應在15~25℃×10min,后面步驟同處理組。

7. 玻片干后,加50μl TUNEL反應混合液(陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液)于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。

8. PBS漂洗3次;

9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞(激發光波長為450~500nm,檢測波長為515~565nm);

10. 玻片干后加50μl converter-POD于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。

11. PBS漂洗3次;

12. 在組織處加50~100μlDAB底物,反應15~25℃×10min;

13. PBS漂洗3次;

14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復染,幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

15. 加一滴PBS或甘油在視野下,用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200~500個細胞)并拍照??山岷系蟯魷赴翁卣骼醋酆嚇卸希ㄎ慈舊赴湫?,胞膜完整但出現發泡現象,晚期出現凋亡小體,貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落;而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質分割成塊狀/凋亡小體)

對于.培養細胞的預處理:
①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸(見備注4),干燥后在去離子水中漂洗,干燥后4℃保存;
②適當方法誘導細胞凋亡,同時設未經誘導的對照組,各組離心收集約1×106個細胞,PBS洗一次,重懸,加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上,自然干燥,使細胞很好的吸附到載玻片上;
③將吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛(見備注2)中固定25min;
④PBS浸洗二次,每次5min;
⑤將吸附細胞的載玻片在0.2%的Triton X-100(見備注5)中處理5min;
⑥PBS浸洗二次,每次5min;

后續操作如同石蠟包埋切片的6—15

四、 注意事項

1. 進行PBS 清洗時,每次清洗5 min。

2. PBS清洗后,為了各種反應的有效進行,請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應。

3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后,請蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進行,這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。

4. TUNEL反應液臨用前配制,短時間在冰上保存。不宜長期保存,長期保存會導酶活性的失活。

5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制。

6. 用甲基綠(Methyl Green)染液(3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后,請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈(100%乙醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時,甲基綠比較容易脫色,注意快速進行脫水操作。

7. 熒光素標記的dUTP液含甲次酸鹽和二氯鈷等致癌物,可通過吸入、口服等途徑進入機體,注意防護。

8. 試劑保存;未打開的試劑盒貯存在-20℃(-15~25℃);converter -POD液一旦解凍,以后就保存在4℃(2~8℃)下,至少在6 m內穩定,避免再次凍存;TUNEL反應液臨用前配好后,放至冰上直至使用。

9. 結果分析時注意:在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產生大量DNA斷,從而引起假陽性結果;而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全,以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內反應,進而產生假陰性結果。

 

     

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